Limites des milieux de culture pour la dénombrement des flores bactériennes viables dans les échantillons environnementaux

0. Selectivité du milieu de culture et temps d'incubation: en fonction du milieu de culture les bactéries vont ou pas se développer pour former des colonies, l'état physiologique de certaines bactéries nécessitent des temps d'incubation particulièrement longs pour leur permettre de se réparer et de se répliquer pour former des colonies sur les géloses. Si les nutriments du milieu de culture sont trop riches ou ne font pas partie des substrats nécessaires à la croissance de ces bactéries, elles ne se développeront pas sur le milieu de culture. On estime par exemple à moins de 1% du nombre réel de bactéries viables présentes dans l'eau potable, capables de pousser sur milieu PCA. Depuis que l'eau potable est chlorée le nombre d'unités formant colonies à diminuer, ce qui peut arranger les compagnies des eaux, mais ne signifie aucunement que le nombre de cellules bactériennes viables est en nette diminution. Bien au contraire en augmentant les doses de chlore, ont a effectué une sélection parmi les souches résistantes et l'on a augmenté le nombre de bactéries viables non cultivables.
0. Le nombre de cellules bactériennes à l'origine des unités formant colonies sur milieu de culture: pour les néophytes, le nombre de colonies formées sur les géloses équivaut au nombre de cellules bactériennes dans l'échantillon, mais en réalité les bactéries présentes dans l'environnement se retrouvent sous forme de flocs. Une colonie sur une gélose peut dont être formée à l'origine par 50 voir 100 microorganismes voir plus. Un échantillon environnemental peut avoir le même nombre de colonies sur boite de Pétri qu'un autre échantillon mais avoir été formées à l'origine par cent fois plus de bactéries.
0. Les bactéries viables non cultivables (VBNC): On a constaté que même lorsqu'on met sur gélose une dilution d'une culture pure, un certain nombre de bactéries ne formeront pas de colonies, suite au stress de la mise sur gélose. Un certain nombre seront donc viables mais non cultivables. Lorsqu'on utilise d'autres techniques de comptage des bactéries viables avec par exemple la cytomérie couplée à des marqueurs de l'activité estérasique (tel le ChemChrome) ou par la méthode DVC (Direct Viable Count), ont peu avoir 3 logs 10, voir 5 logs 10 de différences entr ces méthodes et le milieu de culture R2A incubé de 10 à 15 jours. Les milieux de cultures utilisés pour l'analyse des échantillons environnementaux ne sont vraiment que la partie visible de l'iceberg que représente le nombre réel de cellules bactériennes dans l'échantillon.

Les méthodes rapides quantitative et semi-quantitative des bactéries viables

L'atpmétrie bactérienne différente de la mesure de l'ATP total ou de l'extraction d'Atp par filtration:

L'atp total est une méthode de mesure de l'ATP total présent dans toutes les cellules d'un échantillon déclenchant inutilement des faux positifs (une seule cellule de micro-algue, pollen, somatique contient plus d'ATP que mille bactéries).  Certaines méthodes d'ATP total ont des techniques de filtration permettant d'évacuer l'Atp exo-cellulaire et à l'état libre de la solution à analyser, mais ne font aucune discrimination entre les cellules végétales, somatiques et les bactéries ( voir Atpmétrie). Seule une méthode permettant de lyser les cellules non bactériennes et libérer l'Atp de ces cellules avant d'extraire l'ATP des bactéries viables permet de discriminer l'Atp bactérien, ce est l'objet du brevet détenu pour la technologie du PROFILE-1.

La cytométrie en flux couplée aux marqueurs de viabilité-mortalité:

La cytométrie en phase solide couplée au ChemChrom:

La microscopie en épifluorescence couplée aux marqueurs de viabilité

Pourquoi la PCR (Polymerase Chain Reaction) ne quantifie pas les bactéries viables dans les échantillons? Bon nombre de bactéries gardent leurs membranes intactes même lorsqu'elles sont mortes. Leur ADN est répliqué en même temps que l'ADN des bactéries viables. En cytométrie en phase solide on a par exemple pu constaté dix fois plus de légionella pneumophila mortes que viables présents dans certains échantillons d'eau chaude sanitaire. La PCR quantitative n'est donc pas un moyen fiable d'alerte, car les unités génomes/litres ne peuvent garantir qu'il s'agit d'unité génomes de bactéries vivantes. Les biofilms peuvent contenir bon nombre de bactéries mortes emprisonnées dans les exopolymères du biofilm pour être libérées plus tard par les forces de cisaillement qui arrachent régulièrement des pans de biofilm.