Qu'est-ce que l'ATP?

L'Atp est l'Adénosine Triphosphate, molécule produite dans toutes les cellules vivantes servant à stocker ou à libérer l'énergie en vue de réaction intra ou extra-cellulaire.

Lorsque les cellules meurent et leurs membranes se dégradent l'ATP est libéré de la cellule

La production d'ATP intracellulaire s'il est détectée confirmerait que les cellules présentes dans l'échantillon sont encore vivantes. L'Atp pouvant provenir de cellules aussi variées que la peau, les cheveux ou les poils ou d'autres cellules somatiques,  de cellules végétales tels que les pollens, de bactéries, de levures, de moisissures, de micro-algues ou de protozoaires, la bioluminescence de l'Atp intracellulaire total sans aucune discrimination du type de cellules n'apporterait pas d'informations exploitables. Il est donc nécessaire de pouvoir discriminer et identifier l'origine de l'Atp extrait pour en exploiter les résultats.

Comment détecte t'on l'ATP?

Réaction de la Luciférine/Luciférase (Substrat-Enzyme) en présence de molécules d’ATP

Limites de l'Atpmétrie totale ou

par concentration cellulaire sur filtre toupie : 

faux négatifs, faux positifs sans corrélation, et perte en sensibillité (100 fois moins sensible que la technologie Profile-1

• Pas de distinction de l’ATP bactérien de l’ATP total
• L’ATP non bactérien dépasse largement les valeurs d’ATP bactérien:
  • ATp d'une seule cellule de peau, cheveu, ou de sang> 1000 bactéries
  • Atp d'une cellule végétale> 1000 bactéries
• déclenche inutilement de faux positifs à cause de valeurs de bioluminescence gonflée par l'Atp libre et/ou l'Atp intracellulaire non microbien
• ayant pour conséquence qu'il n'y a pas de corrélation avec les milieux de cultures sensibles:
• donc pas de publications scientifiques indépendantes disponibles 

Faux négatifs de l'Atpmétrie classique: laisse croire qu’il ya peu de bactéries, alors qu'en réalité il y en a beaucoup

• Pourcentage d’inhibition imprévisible dans un échantillon environnemental:

• nombre et concentration de substances inhibitrices inconnues d'un échantillon à un autre

• Pas d évacuation du tout ou d'évacuation suffisante des substances inhibitrices avant détection de l’ATP :

• même les techniques de concentration des cellules ne rinçant pas les couches de cellules concentrées au fons du filtre toupie peuvent libérer des susbtances inhibitrices

• les méthodes d'Atp total par écouvillons libèrent les substances inhibitrices tels que les chelatants, ions métalliques, acides humiques et fulviques, les traces de biocides, dans la luciférine-luciférase

• conséquence la bioluminescence est réduite voire détruite ou inhibée par les substances inhibitrices présentes

  • réduction du signal de bioluminescence > 90% (Velasquez, 199)

Manque de sensibilité des méthodes d'Atpmétrie utilisées :

Faible volume prélevé par écouvillonnage (0.1ml prélevé pas représentatif de la population bactérienne dans un milieu liquide)

une méthode d'extraction tel que celle de LuminUltra et d'Aquatools sur filtre-toupie de l'Atp n'analyse pas plus de 1% de l'Atp extrait (voir principe décrit ci-dessous)

l'extraction d'Atp par filtration et concentration cellulaire totale sur filtre-toupie n'analyse pas plus d'1/100ème de l'Atp extrait:

on est obligé de diluer l'extractant trop agressif pour la mélanger directement à la luciférine-luciférase, et d'autre part on ne peut prélever pour la cuvette du bioluminomètre tout au plus que 100 microlitres pour l'analyse

conséquence une importante perte en sensibilité de la mesure de l'atp cent fois moins sensible qu'elle devrait être

un sérieux handicap pour analyser les échantillons faiblement chargés en bactéries, même si on augmente les volumes de filtration

Conditions à remplir pour que la mesure d'ATP soit corrélée avec les milieux de cultures sensibles ou les méthodes rapides de détection de bactéries viables:

1. évacuation préalable des substances inhibitrices avant analyse de l'Atp
2. éviter de diluer pas l'ATP intracellulaire extrait de l'échantillon mais détecter tout l'Atp microbien ou bactérien extrait des cellules
3. éviter les faux positifs par une extraction sélective de l'ATP non bactérien et son évacuation
4. lessivage et évacuation de l'Atp libre présent dans l'échantillon
5. extraction sélective et détection par bioluminescence de l'ensemble de l'ATP bactérien et/ou microbien sans aucune dilution
6. être capable de réactiver les spores bactériennes (sans activité intracellulaire et sans production d'Atp intracellulaire) avant leur détection par bioluminescence

Pour répondre à ses besoins une seule solution

la technologie brevetée Profile-1

100 fois plus sensible que les méthodes classiques de mesure rapide de l'ATP:

• corrélée avec les milieux de cultures les plus sensibles et publié scientifiquement (voir bibliographie)
• insensible à la présence de substances inhibitrices grâce à un système de lessivage breveté
• discrimine l'atp bactérien de l'atp non microbien tels que l'atp des cellules somatiques
  
• détectant les spores bactériennes (grâce à un protocole ingénieux de réactivation)
• analyse séparément les levures et moisissures,  des bactéries dans un  même l'échantillon.
• concentre les microorganismes dans une même cuvette filtre brevetée Filtravette  et analyse tout l'Atp microbien ou bactérien extrait sans avoir à diluer l'Atp extrait
  
• prélève et concentre les microorganismes dans un volume suffisamment représentatif (10 ml ou plus si nécessaire pour l'eau à trés faible population bactérienne).
  

module de concentration liquide vissé à la seringue contenant l'échantillon
dans le concentrateur liquide se trouve la cuvette filtre brevetée Filtravette, le concentrateur cellulaire permet de concentrer les microorganismes du liquide sur le fonds de la membrane de la cuvette-filtre Filtravette
les microorganismes dans le liquide sont concentrés à travers le concentrateur cellulaire contenant la  cuvette-filtre Filtravette, le concentrateur contenant la Filtravette est ensuite démonté et la cuvette Filtre est extraite voir ci-dessous

 

la cuvette-filtre brevetée Filtravette est composé d'une cuvette dont le fonds est un filtre dont la porosité est adaptée aux différents types de microorganismes à analyser. Deux types de Filtravettes existne:  l'une pour bactéries et l'autre pour levures moisissures  et protozoaires (ci-dessus bord cerclé de vert.
Pour l'analyse combinée des levures, moisissures, protozoaires séparément des bactéries la seringue peut être montée de 2 concentrateurs cellulaires en série (photo à droite ci-dessus) permettant de séparer par seuil de coupure les bactéries des autres microorganismes.
La cuvette filtre Filtravette est unique au monde et permet dans le même contenant sans aucun transfert ni dilution

1. de concentrer et de séparer les microorganismes en fonction de leur taille
2. de lessiver le filtrat retenu sur le filtre des substances inhibitrices de la bioluminescence de l'Atp (plus de faux négatifs)
   
3. d'extraire l'Atp des cellules non microbiennes retenus sur le fonds de membrane de la cuvette et de l'évacuer avant l'analyse de l'Atp microbien ou bactérien (plus de faux positifs)
   
4. d'extraire l'Atp microbien et/ou levurien et/ou  bactérien dans la même cuvette
5. de mesurer tout l'Atp bactérien et/ou microbien intracellulaire sans aucune dilution et d'avoir une mesure au moins 100 fois plus sensible que les autres méthodes
   

Des réactifs sélectifs remarquables éliminant les risques de faux positifs et  faux négatifs
Le réactif utilisé pour l'extraction de l'Atp des cellules non microbiennes (SRA) n'endommage pas les cellules bactériennes ni levuriennes. Les microorganismes restent intact sur le fonds de la membrane de la Filtravette et son prêt après le lessivageà etre analysé par Atpmétrie dans le luminomètre.
Le réactif d'extraction de l'Atp bactérien est extrêmement efficace aussi bien pour les levures que les bactéries à Gram positif ou négatif, et

Etape 1: lyse des cellules non microbiennes (cellules somatiques) et libération de l'atp non microbien à l'intérieur de la Filtravette

Etape 2: évacuation  par pression positive de l'Atp non microbien avec les substances inhibitrices (chlore, sels, biocides...)et absorption de ces substances sur le buvard

Etape 3: introduction de la Filtravette dans le tiroir ouvert du bioluminomètre utilisant la technologie Profile-1 et lyse des cellules bactériennes et libération de l'Atp bactérien dans la solution

Etape 4: ajout de la luciférine/luciférase et mélange avec l'Atp bactérien

Etape 5 (non illustré): fermeture du bioluminomètre utilisant la technologie Profile-1 et lecture de la bioluminescence exprimée en Unités Relatives de Lumière

Etape 6 correspondance des unités relatives de lumière en femtomole/ml ou en femtogramme/ml d'échantillon pour connaitre la concentration en cellules bactériennes ou microbiennes viables dans l'échantillon

• Détection de croissance anormale des bactéries thermophiles des eaux de Tours aéro-réfrigérantes

• Détection des croissances anormale de flores bactériennes des réseaux ECS susceptibles d'être colonisés par légionella pneumophila. (surveillance des points critiques de stagnation dans lesquels les légionelles et les légionella pneumophila sont susceptibles de se développer sont sujets à stagnation et donc présentent la plupart du temps des flores totales importantes.

• Surveillance des concentrations bactériennes de l'eau potable
  

• Vérification des rinçages de canalisations avant envoi de l'échantillon au laboratoire

• Analyse de la qualité microbiologique de l'air intérieur et extérieur
  

• Contrôle bactérien des surfaces en milieu ultra-propre ou en agro-alimentaire